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精子发生减数分裂过程中相关基因的研究进展
来源:http://www.cgwx365.com  日期:2017-09-20

哺乳动物中,携带父代基因的精子与携带母代基因的卵子成功结合形成受精卵,标志着一个新生命的开始。这一事件发生的前提是含有成对染色体的生殖细胞能够进行减数分裂,分化产生成熟单倍体配子。目前,减数分裂的过程已明确,针对生殖细胞的研究也已处于分子水平,生殖细胞减数分裂的具体分子机制也有诸多研究。

雄性哺乳动物的生殖细胞自胚胎期开始增殖,但至青春期才启动减数分裂。精子发生过程中减数分裂阶段是一个连贯过程,一经开始便会持续进行,直至形成成熟精子。精子发生中的减数分裂阶段包含多个递进步骤,每个步骤都有多个基因参与其中。

弄清楚这些相关基因出现或缺失的时间、表达的增加或减少以及相互间的作用,有助于进一步研究雄性生殖细胞减数分裂的诱因和机制。本文对一些已经明确及可能参与雄性生殖细胞减数分裂过程的基因作一综述。

一、精子发生减数分裂过程

哺乳动物精子发生包含3个阶段:(1)精原细胞增殖分化产生初级精母细胞;(2)初级精母细胞通过减数分裂产生精子细胞;(3)精子细胞变态后形成成熟精子。其中减数分裂在整个精子发生过程中占有重要地位。精子发生过程中包含两次连续的减数分裂,即初级精母细胞第一次减数分裂和次级精母细胞第二次减数分裂。

第一次减数分裂包括间期和分裂期。间期含有G1、S、G2期3个时相:G1期RNA和蛋白质进行合成,中心粒彼此分离并复制;S期DNA分子复制合成,DNA复制完成标志细胞正式成为初级精母细胞;G2期DNA终止合成,中心粒、微管蛋白完成复制合成。分裂期含前、中、后、末4个时相:其中前期又根据染色体形态变化分为细线期、偶线期(配对期)、粗线期、双线期和终变期(浓缩期),至此染色体紧密凝集并靠近核的周围,核膜、核仁消失;

中期,细胞质中纺锤体形成,成对的同源染色体移向细胞中央赤道板,着丝粒成对排列在赤道板两侧;后期,在纺锤丝的牵引下,各成对同源染色体分离,并移向细胞两极;末期,染色体到达两极后重新聚集,核膜、核仁重现,细胞分裂为两个子细胞。这两个子细胞即次级精母细胞,次级精母细胞紧接着发生第二次分裂。

第二次减数分裂分为间期、前期、中期、后期和末期,因第二次减数分裂无DNA复制和同源染色体交换重组等过程,间期和前期存在时间短暂,也可将两者直接归入第一次减数分裂末期;中期,染色体着丝粒排列在细胞中央赤道板;后期,姐妹染色单体分离,成为两条染色体并移向细胞两极;末期,染色体到达两极,核膜、核仁重新出现,细胞分裂为两个子细胞。这两个子细胞即精子细胞。至此,整个减数分裂过程结束。

二、精子发生减数分裂相关基因

1.视黄酸应答基因8(Stra8):Stra8是视黄酸(Retinoicacid,RA)应答基因中的一种,其被普遍认为是减数分裂启动的关键基因。雄性小鼠体内Stra8基因仅在睾丸中表达,小鼠出生后5dStra8开始表达,青春期性成熟后Stra8高表达。

Stra8基因编码一个富含谷氨酸的蛋白质,该蛋白有9种磷酸化形式。Stra8蛋白可以在细胞核和细胞质之间来回穿梭,同时其又可以和DNA结合促进转录过程。因此推测Stra8在启动减数分裂过程中起到转录因子或者磷酸化信号蛋白的作用。

Stra8基因敲除的雄性小鼠不育,基因敲除的幼龄小鼠生精细胞未出现第一次减数分裂前期的典型形态学特征,精子发生过程阻滞在间期,推测Stra8与减数分裂的启动密切相关。

Stra8的表达受RA调节,睾丸内的RA又可被支持细胞分泌的细胞色素P450家族26亚族B成员1(Cyp2626bb1)降解,而Cyp2626bb1的分泌又具有时相性(胚胎期多,青春期少),因此雄性小鼠减数分裂在青春期才开始,胚胎期仅进行原始生殖细胞的增殖。

最近研究发现,胚胎期支持细胞不仅抑制Stra8的表达,阻止原始生殖细胞进入减数分裂,还在某一特定时期表达某种或某些分子,确保原始生殖细胞朝雄性而非雌性生殖细胞方向分化。推测正是由于这两种作用使得原始精原细胞在青春期前能够顺利分化形成,并在青春期才开始受Stra8的调节,最终形成成熟的雄性单倍体配子。

Saba等研究指出,胚胎期抑制RA可以促进雄性生殖细胞分化形成,并且Cyp2626bb1直接抑制RA调节的两种通路:依赖Stra8的减数分裂途径和非依赖Stra8的有丝分裂途径。此外,Stra8的表达时机十分重要,其过早表达雄性生殖细胞会提前进入减数分裂,睾丸癌的发生几率大大提升。

Stra8在减数分裂启动中有着重要作用,本文简略提及其表达时机、被调控机制以及在减数分裂启动中的可能作用,但其启动减数分裂的具体分子机制及与之作用的下游基因等还有待进一步研究。

2.联会复合体蛋白3(Sycp3):Sycp3基因属于Cor1基因家族,其编码的蛋白为DNA结合蛋白,主要表达在初级精母细胞中,参与第一次减数分裂偶线期同源染色体配对过程中联会体复合物的形成。

Sycp3蛋白自身会形成一个高度延伸的螺旋四聚体结构,其氨基端杆状结构与DNA双链结合,自姐妹染色单体远端将两个同源染色单体结合在一起;同时,Sycp3会自组装出一个规律的网状结构,猜测是通过这两个结构Sycp3蛋白将两个同源染色体稳固地联会在一起。

Sycp3基因敲除的纯合子雄性小鼠不育,其睾丸体积明显变小并伴有大量生精细胞凋亡。在常染色体上Sycp3蛋白作为一个组件参与同源染色体联会复合物的形成,其定位随着染色体形态不同而改变。

染色体联会起始于两侧端粒,逐渐向着丝粒合拢,Sycp3可特异性地与着丝粒区域相关联,却不参与同源染色体着丝粒的联会。X、Y染色体联会由Sycp3产生一个复杂的网络状结构包裹Y染色体和X染色体长臂末端,使二者以尾端接尾端的形式联会在一起。

推测Sycp3敲除小鼠不育是因为不能正确地形成联会体复合物,继而不能正确完成减数分裂,最终导致无法形成正常精子。多种癌组织中Sycp3表达也会升高,Cho等研究证实,Sycp3可激活丝/苏氨酸激酶(AKT)路径的癌症通路,其表达量与宫颈癌的发生率、严重度,以及预后有很大关联。Sycp3作用并不单一,其表达量增加可产生负面影响,但Sycp3表达增加是否引起睾丸癌的发生继而影响雄性生育,还需更多研究去证实。

Sycp3是同源染色体联会成功的重要因素,其缺失后减数分裂停滞,即使少数细胞未停滞,最终也只能形成异倍体配子。Sycp3蛋白对减数分裂而言是必须的,但其详细的分子机制还需继续研究,其表达量变化的影响也值得进一步研究探讨。

3.DNA减数分裂重组酶1(Dmc1):Dmc1蛋白最早发现于酵母中,是一个仅在减数分裂过程中表达、与同源染色体基因重组相关的蛋白。Dmc1缺陷的纯合型雄性小鼠不育,其精子发生停滞于第一次减数分裂前期,免疫荧光未见粗线期的精母细胞,而Dmc1敲除的杂合型小鼠和野生型小鼠生殖细胞内染色体同源重组发生概率无统计学差异。

由此表明Dmc1为减数分裂染色体同源重组必不可少的。Dmc1蛋白拥有大肠杆菌RecA蛋白家族中保守的第二结构域部分,包括两个三磷酸腺苷(ATP)结合位点和DNA结合区。

Dmc1缺陷的生精细胞会积累大量的重组中间体:双链断裂的DNA分子。Dmc1受DNA结合转录因子Swi5及依赖Swi5的重组修复蛋白1(Swi5-Sfr1)复合物介导,与单链DNA(ssDNA)结合参与DNA双链的重组,Swi5-Sfr1复合物为Dmc1的激动剂;而DNA重组修复酶22(Rad22)则会竞争性地结合ssDNA,作为Dmc1的抑制剂拮抗Dcm1重组基因的功能。Dmc1和Rad51共同参与染色体同源重组过程,DaInes等发现在拟南芥体内Rad51仅发挥协助Dmc1进行重组的作用。

而Lao等在研究出芽酵母时发现Rad51是可以独立发挥重组作用的,解除其抑制因子Hed1作用后,Dmc1敲除的酵母体内出现大量基因重组现象,但重组的发生有些混乱,不是典型的基因重组,出现姐妹染色单体间的重组。

此外,Dmc1作为基因重组的主要作用因子,其通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)激酶1(Mek1)路径抑制Rad51的重组功能,保证基因重组只在同源染色体之间正确发生。

同时,Dmc1促进Mek1伴侣蛋白Red1的合成,并介导其参与联会体复合物的形成。这些功能很可能与确保正确的同源染色体基因重组有关。Liu等研究证实在减数分裂过程中,Rad51偏向于在姐妹染色单体之间修复断裂的DNA双链,而Dmc1则偏向于在同源染色体之间修复断裂的双链。

且在减数分裂重组时,Rad51活性降低避免与Dmc1竞争修复断裂的双链DNA,从而保证基因重组能够正确地在同源染色体之间进行,产生的配子有正确、多样的基因组成。

Dmc1作为减数分裂过程中的特异性基因,其存在、调节及作用机制,对减数分裂都具有重要意义。但其更明确的分子机制及在哺乳动物身上的机制研究还需进一步加强。

4.热休克蛋白家族A成员1B(Hspa1b):热休克蛋白是一种大小为70KD的分子伴侣蛋白,参与其它蛋白的折叠、转运及复合物形成等过程。大多数热休克蛋白持续表达可能是在受到热休克等刺激时才发生,而Hspa1b(亦称HSP70-2)是在小鼠睾丸中特定表达的受发育调节的特殊热休克蛋白。

大鼠体内Hspa1b同源物Hst70起始密码子上游约360bp处有一弱启动子,推测正是由于这一弱启动子的存在使得其特定表达在睾丸中。

基因打靶沉默后的Hspa1b-/-雄性小鼠无生育能力,其睾丸中未检测出Hspa1b蛋白,HE染色没有看到减数分裂后的精子细胞或成熟精子,且沉默后减数分裂停滞,大量的精母细胞发生凋亡。

对比出生后12~28d进行第一次减数分裂的青春期小鼠睾丸后,发现精子发生进行到第15天粗线期精母细胞时出现异常情况,第15天开始精母细胞发生凋亡,之后的细胞分化异常,联会体复合物无法结束联会,正常的双线期精母细胞和之后的生精细胞均未观察到,推测Hspa1b与减数分裂中联会体复合物的解联密切相关。

高温和氧化应激是精索静脉曲张引起睾丸损伤的两个重要病因。Khosravanian等的研究发现Hspa1b表达增加可能会抑制精索静脉曲张引起的睾丸损伤。Ji等的研究表明miR-15a结合到Hspa1b的3’端非编码区后会抑制其表达,精索静脉曲张患者体内miR-15a的表达量很少。推测Hspa1b参与睾丸损伤的防御机制,在精索静脉曲张患者体内,其防御性表达增加。

Hspa1b参与生精细胞减数分裂过程,其很可能是联会体复合物解除联会结构所必需的分子伴侣,同时又是某些抗凋亡因子的伴侣,且其作为一个应激蛋白在维持睾丸正常生理功能、拮抗睾丸损伤的过程中也可能具有一定作用。但其功能的多样性及每种多样性的分子机制仍需继续深入研究。

5.减数分裂重组蛋白Rec8(Rec8):Rec8最初在酵母中被发现,其在哺乳动物体内的同源物为Rec8p。Rec8与Stra8一样受RA的调节。雄性小鼠体内Rec8仅在睾丸组织中表达,减数分裂开始前已广泛分布在染色体上。随着同源染色体分离的进行,染色体臂上逐渐检测不到Rec8,只能在着丝粒上检测到,这一状态一直维持至第二次减数分裂后期,姐妹染色单体分离后整个染色质区域不再出现Rec8信号。

同时,Rec8蛋白的降解受分离酶介导,在诱导Rce8基因突变使其蛋白对分离酶敏感性下降后,同源染色体和姐妹染色单体的分离发生异常。提示Rec8在减数分裂过程中与同源染色体及姐妹染色单体的正确分离存在关联。

Rec8蛋白为黏连蛋白复合物组件之一。第一次减数分裂后期同源染色体分离时,Sgo1蛋白保护位于着丝粒的Rec8蛋白免于被分离酶水解,确保同源染色体分离的同时姐妹染色单体不随之分离,而第二次减数分裂时姐妹染色单体顺利分离。

Wassmann认为在这一阶段,Rec8蛋白受CyclinA2等因子影响发生了磷酸化作用,被分离酶水解,失去原有的功能结构,使得姐妹染色单体不被黏连蛋白连接,继而能够分离。

Rec8蛋白的存在使精子发生减数分裂过程中同源染色体的分离正确进行,避免了姐妹染色单体的过早分离,为成熟单倍体精子的形成提供了保障。目前针对Rec8的研究主要集中在其保护染色单体不过早分离,而其表达的调节以及着丝粒保护与去保护作用的详尽机制等还需要进一步探究。

6.其他基因:除上述基因外,可能参与精子减数分裂过程的基因还有很多。Boule基因是一个进化上高度保守的基因,主要表达在雄性生殖细胞中,Boule缺陷的果蝇会因G2/M期转换障碍导致精子发生受阻。

Boule基因敲除的纯合子小鼠相比杂合子小鼠其第一次减数分裂完成的时间延长约2倍,且精子细胞的缺失更多。睾丸是一个进行高转录活动的场所,特别是精母细胞,很多MicroRNA在减数分裂过程中也发挥着重要作用。

miR-34c已被证实存在于精原干细胞中,且其在之后的精母细胞中表达上调,并已证实其与初级精母细胞的调亡存在关联。Dicer1是一个miRNA合成相关的酶,Dicer1缺失的雄性没有生育能力,且生殖细胞由间期进入第一次减数分裂前期的时间延长,同时初级精母细胞的凋亡增加。

三、结语

雄性哺乳动物精子发生减数分裂过程是的一个特殊的细胞分化过程,多种基因参与其中。Stra8参与启动,Sycp3与联会相关,Dmc1重组断裂的同源染色体DNA,而Hspa1b和Rec8分别与染色体解联、分离存在联系。此外还有一些基因以及小分子RNA在这一过程中发挥作用。

明确这些影响因子及其相互间的作用机制,有助于更好地了解不育的病因并为其治疗提供新思路,还为使用干细胞重组或体细胞分化手段生成具有生育能力的精子提供了新的可能。